如何设计引物?

当序列成功导入到Channel 1后,双击该Channel即可看到序列的详细信息,保持Channel 1处于选中状态,随后通过Sequence菜单选择Display Sequence打开对话框。

最后,对生成的反向互补序列执行与正向引物相同的操作步骤,选择前24个碱基如TCAAAGATCTACCATGTACAGCTC,确认其Tm值为57.6度符合标准,至此正向和反向引物均设计完成,可将序列提交给公司进行合成。

设计引物的第一步是准备好目的基因的序列数据,通常以GFP基因为例,将其保存为txt文档或在软件中直接录入,这是后续所有操作的基础素材。

在Display Sequence对话框中,勾选Reverse Complement Seq选项,并取消其他所有复选框,点击OK后,软件就会自动生成目的基因的反向互补序列。

如果初步测试显示Tm值过低,如上述20个碱基的Tm仅为49度,则需要增加碱基数,例如尝试前24个碱基,查看其Tm值为60.3度,这是一个非常合适的数值,确认后即可将这段24个碱基序列保存,完成正向引物的设计。

为了评估引物的质量,需要再次进入Primer菜单选择Melting Temperature选项,在弹出的对话框中查看碱基序列及其Tm值,即溶解温度,理想的Tm值应处于55℃至70℃之间,而PCR仪的退火温度通常设定为比Tm低5℃,因此Tm在60左右最为适宜。

接着启动DNAMAN软件,通过Primer菜单下的Load Primer功能,从输入端粘贴目的基因开头约20个碱基,比如ATTGATGTGATATCTCCACT,此时需确保引物长度控制在15到30bp之间,常用范围是18-27bp,然后点击OK检查初步可行性。

设计反向引物之前,必须先对目的基因序列进行反向互补处理,这在DNAMAN中可以通过左侧Channel模块,利用Sequence菜单下的Load Sequence功能,选择从序列文件导入之前保存的txt文档来实现。