如何设计引物？
风中的向日葵 为了评估引物的质量，需要再次进入Primer菜单选择Melting Temperature选项，在弹出的对话框中查看碱基序列及其Tm值，即溶解温度，理想的Tm值应处于55℃至70℃之间，而PCR仪的退火温度通常设定为比Tm低5℃，因此Tm在60左右最为适宜。
风中的向日葵 评论 (2)
Tm值确实关键，但别光盯着55-70℃这个区间。实际做实验时，引物内部的二级结构和二聚体形成往往比Tm更让人头疼。建议加上Primer-BLAST查重，再测一下GC含量是否在40%-60%，否则哪怕Tm完美，扩增效率也可能一塌糊涂。
其实Tm在60左右确实是个很安全的区间，不过实际操作中我更看重上下游引物的Tm差值，最好控制在1-2℃以内，不然扩增效率会打折。另外，除了看Tm值，最好再用软件检查一下二级结构和二聚体，免得后期白忙活。